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不同非洲豬瘟病毒實驗室檢測方法的對比

一、簡介

非洲豬瘟（Africann Swine Fever, ASF）是由非洲豬瘟病毒科非洲豬瘟病毒（African Swine Fever Virus，ASFV）感染引起的家豬和野豬的一種急性、熱性、高度接觸性傳染病¹。臨床癥狀與豬瘟極其相似，以高熱、皮膚發紺、內臟器官嚴重出血、呼吸障礙和神經癥狀為主要特征。本病傳播快、致死率高，對養豬業危害巨大，是我國一類動物疫病和世界動物衛生組織（OIE）規定的必須報告的動物疫病，受到世界各國的高度重視²。本病是以節肢動物作為傳播媒介的DNA病毒。ASF已在非洲、歐洲和美洲等幾十個國家暴發，“三全水餃事件”則將非洲豬瘟直接推向大眾的面前。目前，本病尚無有效的預防疫苗和治療藥物，防止疫情擴大的有效措施就是撲殺。因此事先建立簡便、快速、準確的ASFV檢測方法顯得十分必要。本文就ASFV實驗室檢測的不同方法，進行對比分析。

二、檢測方法

2.1 血清學檢測方法

2.1.1酶聯免疫吸附試驗（ELISA）

ELISA利用抗原抗體進行免疫反應的定性和定量檢測，應用于血清抗體的檢測，適用于大批量樣品的檢測。ASFV含有約150種蛋白，目前國內外常用作檢測抗原的蛋白有VP73、VP72、P54、P32、P30等³。

優點：快速、方便。

缺點：（1）一般情況下, 非洲豬瘟病毒進入豬體內， 7天后才能誘導產生較高的Ig G抗體，而7天的時候，足以出現早期臨床癥狀，并已經傳染給其他家豬，因此該檢測方法往往具有難以解決的滯后性。（2）針對不同蛋白會出現個別差異，增加排查的難度³。

2.1.2膠體金免疫層析（GICA）試紙條

運用雙抗體夾心法原理純化后的抗ASFV單克隆抗體制備金標抗體, 應用于檢測ASFV的膠體金免疫層析試紙條，也稱為檢測卡。

優點：使用方便；

缺點：（1）靈敏度低；（2）一般情況下, 非洲豬瘟病毒進入豬體內， 7天后才能誘導產生較高的Ig G抗體，而7天的時候，足以出現早期臨床癥狀，并已經傳染給其他家豬，因此該檢測方法往往具有難以解決的滯后性³。

2.1.3熒光抗體試驗（FAT）

熒光抗體試驗（FAT）可用于檢測野外可疑豬或實驗室接種豬的脾、淋巴結等組織壓片和冰凍切片中的ASFV抗原。

優點：敏感性和特異性較佳；

缺點：需要專業試驗人員，同時需要熒光顯微鏡及高質量的熒光標記抗體。因此僅作為ASFV的輔助檢測方法⁴。

2.1.4免疫組化法

該方法用來檢測急性感染ASFV豬的扁桃體組織病理學變化，通過檢測發現，感染ASFV豬有出血、單核細胞增多現象。免疫組化法對于臨床癥狀不明顯的病例，確診有一定難度，因此，該方法僅作為ASFV的輔助檢測方法。

優點：特異性較佳；

缺點：對于臨床癥狀不明顯的病例，確診有一定難度⁴。

2.2分子生物學檢測方法

2.2.1 PCR

體外擴增基因的一種方法，是目前ASFV常用的實驗室檢測方法。研究表明，非洲豬瘟感染8小時， 便可從血液中檢測到其核酸物質，因此針對非洲豬瘟病毒保守區域設計引物，對采集的血液或組織病料等相關物質進行DNA提取，進行PCR反應，可對其進行快速準確診斷。是目前ASFV常用的實驗室檢測方法。眾多國內外研究^5-9均建立了ASFV的PCR檢測方法，表明該方法具有良好的敏感性和特異性，且可以檢測出極低含量的ASFV，為ASFV早期感染的快速診斷提供了有效的分子生物學檢測方法。

優點：簡單快速、靈敏度高和特異性強。

2.2.2 熒光定量PCR

通俗講是PCR的升級版。實時熒光定量PCR比常規PCR具有更高的敏感性和特異性，可同時快速檢測大批量樣品，其更加敏感、準確。舉例，McKillen等¹⁰（2010）根據9GL基因建立了MGB探針實時熒光定量PCR檢測方法，低可以檢測到20拷貝標準DNA。

優點：敏感性和特異性高。

2.2.3 探針雜交技術

能有效排除PCR檢測過程中的非特異性結果， 省去了瓊脂糖凝膠電泳步驟，操作簡便、檢測迅速，在酶標板中可批量反應，為ASFV核酸檢測方法開辟了新的途徑，

該方法的建立難度較高、操作較繁瑣， 對實驗人員技術水平要求較高。

三、小結

• 目前，ASFV的檢測技術主要有針對病毒DNA的核酸檢測技術和基于病毒抗原、抗體反應的免疫學技術兩大類。
• OIE推薦檢測ASFV的方法主要有PCR、實時熒光定量PCR、ELISA等。用免疫學方法檢測抗體可以了解ASFV感染、發生、發展的進程，但抗體只有在病毒感染至一定時期后才會出現，故ELISA等抗體檢測方法存在一定的局限性和滯后性。
• PCR、實時熒光定量PCR等分子生物學技術在豬感染ASFV的早期即可檢測到病毒核酸，在ASFV的早期檢測中具有重要作用。
• 總之，ASFV的實驗室檢測方法多種多樣，但若要求檢測結果準確、快速、敏感，我們推薦PCR、實時熒光定量PCR的方法，這不僅對感染ASFV的動物治療非常重要，而且對未感染的動物及時采取有效的預防措施同樣具有重要的意義。

• 隨著免疫學與分子生物學技術的不斷發展，ASFV的實驗室檢測方法必將不斷完善，進一步為我國開展ASF的監測與綜合防控提供技術支持。

【參考文獻】

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2. 王君瑋, 張玲, 王志亮, 王華, 包靜月. 非洲豬瘟傳入我國危害風險分析. 中國動物檢疫 2009; 26 (3):63-66.

3. 常華, 花群義, 段綱. 非洲豬瘟病毒的分子生物學研究進展. 微生物學通報 2007; 34 (3):572-575.

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7. Agüero M, Fernández J, Romero LJ, Zamora MJ, Sánchez C, Belák S, et al. A highly sensitive and specific gel-based multiplex RT-PCR assay for the simultaneous and differential diagnosis of African swine fever and Classical swine fever in clinical samples. Veterinary Research 2004; 35 (5):551-563.

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9. Basto AP, Portugal RS, Nix RJ, Cartaxeiro C, Boinas F, Dixon LK, et al. Development of a nested PCR and its internal control for the detection of African swine fever virus (ASFV) in Ornithodoros erraticus. Archives of Virology 2006; 151 (4):819-826.

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